RNAi干擾檢測技術(shù)要點

 　　RNAi干擾檢測技術(shù)要點
　　RNAi干擾檢測 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象。基因沉默，主要有轉(zhuǎn)錄前水平的基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常轉(zhuǎn)錄;PTGS是啟動了細胞質(zhì)內(nèi)靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉(zhuǎn)基因會同時導致TGS和PTGS。
　　RNAi干擾檢測 主體實驗：
　　一、成功將siRNA表達載體導入目的細胞
　　如果目的細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較低（低于70%），則應(yīng)采用腺病毒或慢病毒載體，利用病毒載體的高感染率、高表達特性，更好地開展RNA干擾主體實驗。
　　二、設(shè)置好分組和對照
　　按照nature的標準，一個嚴格的RNAi介導knockdown實驗要有6個對照：
　　⒈轉(zhuǎn)染試劑對照（監(jiān)控轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件對結(jié)果的影響）；
　　⒉nonsense siRNA對照（監(jiān)控外源核酸本身對結(jié)果的影響）；
　　⒊positive siRNA對照（監(jiān)控假陰性）；
　　⒋技術(shù)重復對照（也叫off-target 對照，也就是利用至少2個靶點的siRNA同時實驗，2個siRNA互為off-target control，當兩者的表型相同時，才有可能是特異性的knockdown效應(yīng)）；
　　⒌rescue 對照（knockdown之后做超表達，看是否有性狀的逆轉(zhuǎn)，這也是為了說明knockdown的特異性）；6.全表達組掃描對照（就是轉(zhuǎn)錄/表達芯片掃描，以zui終確定表型不是由于off-target造成）。
　　實際實驗中，全表達組掃描對照很少有文獻涉及。其它幾個對照中，1,2兩種對照即所謂的空白細胞對照、NC對照，基本是所有雜志都要求具備的。4,5兩種對照，主要是為了解決off-target效應(yīng)，選做一種即可，一般建議選5，涉及的實驗即所謂的“RNA干擾回復實驗”，
　　三、RNA干擾效率的檢測（體外）
　　一般應(yīng)該從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平、細胞表型水平三個層次來檢測干擾效率。
　　mRNA水平：RT-PCR、Real-time PCR；蛋白質(zhì)水平：Western-blot、ELISA、免疫組化；細胞表型水平：MTT、克隆形成實驗、流式細胞檢測、細胞小室實驗等。RNA干擾效率在動物模型上的進一步驗證（體內(nèi)）　動物模型實驗可以采取“體內(nèi)法”和“體外法”。
　　體內(nèi)法，即先做裸鼠成瘤模型，再將質(zhì)粒或病毒導入裸鼠，檢測RNA干擾效果。此法操作復雜，對質(zhì)粒和病毒產(chǎn)品的質(zhì)和量要求都較高，但是比較貼近實際，說服力較顯著。體外法，即先將質(zhì)粒或病毒導入腫瘤細胞，再將腫瘤細胞導入動物體內(nèi)，然后檢測RNA干擾效果。此法操作較簡單，對質(zhì)粒和病毒產(chǎn)品的質(zhì)量要求較低，所以為大多數(shù)文獻所采用。建議采用此方法來進行動物模型水平的實驗。